|
Современный капиллярный секвенатор (капиллярный генетический анализатор, секвенатор 1 поколения, классический секвенатор) — автоматический прибор, позволяющий проводить секвенирование и фрагментный анализ нуклеиновых кислот по методу Сэнгера (см. ниже). Разделение фрагментов ДНК сейчас в автоматических капиллярных секвенаторах проводится путем капиллярного электрофореза, ранее это делалось в ручную в плоских гелях с использованием радиоактивной метки.
В капиллярном секвенаторе для анализа используется гомогенная проба (очищенный раствор молекул НК, полученных из одного источника, одинаковой структуры и практически одинаковой длины). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участков ДНК, последовательность которых требуется определить. В результате получается гомогенная проба одинаковых ДНК-фрагментов. Негомогенность исходной пробы, или ошибки в ходе ПЦР-реакции могут привести к тому, что не удастся однозначно определить генетическую структуру молекулы нуклеиновой кислоты.
В отличие от капиллярных секвенаторов в NGS–секвенаторах возможно секвенирование негомогенных проб ("библиотека" молекул НК, которые могут отличаться по длине, по структуре и могут быть получены из различных источников).
|
Устройство капиллярного секвенатора
|
Секвенирование ДНК по Сэнгеру — «золотой стандарт» секвенирования, это самый точный метод определения последовательности ДНК на сегодняшний день, который использует относительно дешевые расходные материалы при небольшом потоке образцов. Принцип метода — встраивание терминирующих нуклеотидов (модифицированные трифосфаты, обладающие в 3'-положении водородом вместо гидроксильной группы, поэтому при их включении в ДНК происходит прекращение синтеза цепи) в синтезируемую цепь ДНК. В реакционной смеси находятся ДНК-матрица, праймер, ДНК-полимераза и смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов и их модифицированных аналогов — дидезоксинуклеотидтрифосфатов. В современной версии секвенирования ДНК по Сэнгеру каждый терминирующий трифосфат (ddATP, ddGTP, ddTTP и ddCTP) помечен соответствующим флуоресцентным красителем. Поэтому фрагменты ДНК светятся разным цветом — в зависимости от того, какой терминирующий трифосфат встроился в цепь.
Реакцию проводят циклически (аналогично ПЦР), многократно повторяя синтез новых одноцепочечных фрагментов. Так как ddNTP составляют около 5% от dNTP, в конце такой (линейной) амплификации после 40-50 циклов получается набор одиночных цепей ДНК, отличающихся по длине на 1 нуклеотид и всегда заканчивающихся меченым нуклеотидом.
Разделение фрагментов по длине происходит с помощью капиллярного электрофореза, визуализация результата представляет собой электрофореграмму с цветными пиками. В настоящее время длина секвенируемых таким способом фрагментов достигает 1000 пар нуклеотидов.
Области применения капиллярных секвенаторов: секвенирование геномов de novo, SNP-типирование (онкология, сельскохозяйственная геномика) подтверждение данных NGS-секвенирования, секвенирование микроорганизмов, секвенирование митохондриальной ДНК (анализ родства).
|
Фрагментный анализ ДНК — разделение флуоресцентно меченых фрагментов ДНК с целью определения их «относительного» размера — широко применяемый метод исследования ДНК. Метод основан на электрофоретическом разделении фрагментов ДНК, но при этом определяется «относительная» длина каждого фрагмента в парах нуклеотидов. Это достигается тем, что один из праймеров, участвующих в ПЦР перед стадией электрофореза несет на себе флуоресцентную метку, которой метятся фрагменты определенной длины. Затем проводят электрофорез в присутствии фрагментов ДНК известной длины (размерный стандарт) и устанавливают длины исследуемых фрагментов ДНК. Фрагментный анализ возможно проводить и с помощью других методов электрофореза (горизонтальный электрофорез с последующей трансиллюминацией, электрофорез капиллярный на чипе), однако использование для фрагментного анализа капиллярных секвенаторов позволяет определять длины фрагментов с точностью до 0,5 нуклеотида*, что весьма важно для STR- и SNP-генотипирования.
*Измерение длины фрагментов, разгоняемых по полимеру, относительное, производится на основании калибровочной прямой в ходе разгона размерного стандарта и, соответственно, относительные длины вычисляются вплоть до сотых долей нуклеотида Чем выше разрешающая способность, тем легче и точнее различаются между собой фрагменты с разницей в 1 нуклеотид. Кроме того, при амплификации (например, в результате неполного аденилирования) возникает множество артефактов с длиной как раз отличающейся на 1 нуклеотид от истинного аллеля, но с низкой RFU, и повышение разрешающей способности становится важным. На горизонтальном электрофорезе такие фрагменты различить сложно и это часто приводило к ошибкам раньше.
Области применения фрагментного анализа: анализ STR маркеров человека (идентификация личности, анализ родства, наследственные заболевания, идентификация клеточных линий и многое другое), генотипирование животных (паспортизация и идентификация), генотипирование растений (виноград, картофель, свекла и другие культуры), SNP генотипирование.
|
Принцип секвенирования по Сэнгеру
|
Главный критерий выбора капиллярного секвенатора — количество капилляров (от 4 до 96) и в зависимости от этого производительность по количеству исследованных образцов в день.
Для лаборатории с невысокой производительностью оптимально подойдет секвенатор с 4 капиллярами (до 128 образцов в день) SeqStudio, который к тому же имеет картридж со встроенной помпой и реагентами, что позволяет свести обслуживание прибора к минимуму.
Для большинства лабораторий стандартной производительности оптимальным решением будет 8-капиллярный (до 256 образцов в день) секвенатор. В случае высокой производительности лаборатории необходим в секвенатор с 24, 48 или даже 96 капиллярами.
Наличие Регистрационного удостоверения РосЗдравНадзора уточняйте у специалистов Диаэм.
|
Типичная электрофореграмма фрагментного анализа
|
