Современные ДНК-лигазы одинаково быстро и эффективно сшивают как липкие, так и тупые концы. Одна из таких разновидностей лигаз используется в готовых наборах для клонирования
CloneJET PCR, Thermo Fisher Scientific.
Наборы
CloneJET PCR – это оптимизированные системы с позитивной селекцией для эффективного клонирования ПЦР-продуктов, синтезированных любыми термостабильными ДНК-полимеразами. С помощью наборов
CloneJET PCR можно клонировать ДНК-фрагменты с любыми концами – тупыми или липкими, фосфорилированными или не фосфорилированным. Лигирование занимает всего 5 минут, а выход рекомбинантных клонов составляет более 99% благодаря использованию вектора pJET1.2/blunt с позитивной системой селекции.
Примеры применения:
- клонирование продуктов ПЦР с тупым или 3'-dA-концом длиной до 10 кб;
-
клонирование фрагментов ДНК, генерируемых рестрикционными ферментами;
-
секвенирование клонированной ДНК;
-
транскрипция in vitro и in vivo клонированных вставок из промотора T7.
Клонирование с использованием наборов
CloneJET PCR включает в себя этап достройки липких концов, получающихся при использовании для ПЦР стандартной Taq-полимеразы или при рестриктазном расщеплении ДНК. При этом реакция лигирования тупоконечной вставки длиной до 3000 пар нуклеотидов с линейным вектором занимает всего 5 минут (при более длинных вставках время лигирования увеличивается). Позитивная селекция клонов со вставкой осуществляется за счёт встраивания клонируемого фрагмента в последовательность летального гена
eco47IR, тем самым выключая этот ген и обеспечивая жизнеспособность рекомбинантных клонов.
Преимущества наборов CloneJET PCR:
- универсальный вариант для клонирования фрагментов с тупым или липким концами;
- быстрое клонирование ПЦР-фрагмента всего за 5 минут;
- эффективность – более 99% положительных клонов;
- отсутствие фоновых клонов с «пустым» вектором.
