Выделение экзосом: от фундаментальных исследований до клинического применения

Внеклеточные везикулы и экзосомы приобретают всё большее значение в медицине и биофармацевтике. Вслед за исследовательским и практическим интересом растёт и предложение специализированного оборудования для их выделения.

В портфеле «Диаэм» представлено несколько решений для выделения экзосом — от классических методов до специализированных автоматизированных систем. Сегодня мы рассмотрим их подробно.

Методов выделения экзосом существует достаточно много. На слайде представлены наиболее распространённые и широко используемые варианты.

Как вы знаете, каждый из них имеет определённые недостатки. Это может быть длительное выделение, большое количество ручных операций, значительные временные затраты, загрязнение полученного материала, низкий выход и другие ограничения. Поэтому потребность в новых методах сохраняется, и соответствующие технологии продолжают появляться.

Если говорить о методах, представленных в портфеле «Диаэм», мы можем предложить несколько решений.

• Ультрацентрифуги Eppendorf — по заявленным скоростям подходят для протоколов выделения экзосом.
• Колонки Servicebio — для выделения экзосом методом эксклюзионной хроматографии. С ними можно достаточно быстро работать непосредственно в лаборатории, без сложной дополнительной инфраструктуры.
• Оборудование для тангенциальной фильтрации — системы ChallengeIM для работы с различными объёмами.
• Система 3D FloTrix vivaEXO компании CytoNiche — специализированная система, в том числе для крупномасштабной работы с экзосомами.

Различные системы тангенциальной фильтрации остаются за рамками основной темы сегодняшней презентации, однако вы всегда можете обратиться к специалистам «Диаэм», и мы предоставим подробную информацию по оборудованию, подходящему для ваших объёмов и задач.

Мы также регулярно проводим демонстрации оборудования. На сайте «Диаэм» публикуются анонсы различных демо, в том числе систем тангенциальной фильтрации. Поэтому рекомендую следить за информацией на сайте.

Сегодня же основное внимание мы уделим новым для нашего портфеля решениям, и начнём с системы EXODUS.

Сначала несколько слов о компании, разработавшей систему EXODUS.

Компания работает в США и Китае. В США расположены её офисы и Application Center, а производство и часть инфраструктуры находятся в Китае. Команда разработчиков международная: основатели и ключевые специалисты работают как в США, так и в Китае.

Компания достаточно крупная: по данным, представленным в материалах производителя, в штате более 140 человек. Часть команды находится в США, часть — в Китае. Производитель обеспечивает хорошую техническую и методическую поддержку и находится в постоянном контакте с пользователями.

EXODUS — это семейство приборов в разных конфигурациях. Для них выпускаются одноразовые расходные материалы различных объёмов и с различными характеристиками.

Одной из ключевых публикаций, после которой технология получила широкую известность, стала статья, опубликованная в Nature Methods в 2021 году. За относительно короткий срок вокруг технологии сформировалась большая компания и появилось значительное количество научных работ с использованием EXODUS.

Принцип работы проще показать, чем долго описывать словами, поэтому в ходе вебинара было продемонстрировано видео производителя.

В основе технологии лежит работа с мембранами и управляемым давлением. В системе используется разница между создаваемым внутри контура отрицательным давлением и атмосферным давлением, что обеспечивает движение жидкости через мембраны и способствует процессу разделения.

Производитель также предусматривает возможность изготовления кастомизированных мембран под конкретные цели и задачи пользователя. То есть для стандартных применений существуют готовые расходные материалы, но при необходимости можно обсуждать специальные характеристики мембран и размеры пор.

Диапазон объёма образца для этой модели составляет от 10 мкл до 50 мл. Для большинства лабораторных исследований этого диапазона уже достаточно.

Особенно интересен минимальный объём — 10 мкл. Возможность выделения экзосом из такого небольшого количества исходного материала встречается не у всех технологий. Для образцов, доступных в крайне ограниченном количестве, это может быть существенным преимуществом.

Максимальная скорость выделения для H-300 составляет около 50 мл/ч. Это не самая высокая производительность, однако для тех объёмов, на которые рассчитан прибор, она не создаёт существенных ограничений.

В материалах производителя для H-300 также встречается обозначение Class I Medical Device. Здесь важно понимать, что речь идёт о регистрации оборудования в отдельных странах и юрисдикциях. На момент проведения вебинара регистрация этой модели в таком качестве в России не планировалась. Если ситуация изменится, мы будем отдельно сообщать об этом.

Вторая модель, и, пожалуй, наиболее универсальная для многих лабораторных задач, — EXODUS H-600.

Здесь диапазон рабочих объёмов значительно шире: от 10 мкл до 250 мл. Это уже позволяет решать большее количество задач, особенно если приходится работать не только с небольшими биологическими образцами, но и с достаточно крупными объёмами культуральных сред или других исходных материалов.

У Н-600 выше и скорость выделения — до 200 мл/ч. Высокая скорость становится особенно важной, когда нужно обработать, например, 250 мл исходного материала, когда образцов несколько или когда лаборатория регулярно выполняет большое количество выделений. Для таких ситуаций Н-600 может быть удобным решением.

Следующая модель — EXODUS T-2800. Это уже система производственного уровня.

Она предназначена для больших объёмов и для получения значительного количества экзосом, в том числе для задач, связанных с дальнейшим технологическим или потенциальным терапевтическим применением.

Диапазон рабочего объёма составляет приблизительно от 0,5 до 10 л. Соответственно, значительно выше и производительность системы — порядка 1–2 л/ч.

Если посмотреть на расходные материалы для этой модели, можно увидеть, что здесь используются уже не только одноканальные варианты. Возможны конфигурации до четырёх каналов, что позволяет увеличивать скорость и общую пропускную способность системы.

У перечисленных моделей существуют дополнительные модификации и подмодели. Они отличаются уровнем автоматизации и рядом других функций. В каждом конкретном случае необходимо оценивать, нужна ли полная автоматизация либо достаточно более простой конфигурации. От этого, естественно, зависит и стоимость оборудования. Это уже вопрос индивидуального подбора под конкретную задачу.

Теперь рассмотрим основные преимущества технологии.

Первое — использование одноразовых расходных материалов. Для кого-то это безусловное преимущество, для кого-то одноразовый формат может восприниматься как дополнительная статья расходов.

Стоимость расходных материалов зависит от модели и объёма. На момент вебинара для стандартных расходных материалов к EXODUS H-300 и EXODUS H-600 речь шла ориентировочно о диапазоне от нескольких тысяч рублей за запуск, в зависимости от конкретного типа картриджа и его характеристик.

При этом одноразовые расходные материалы позволяют добиться высокой воспроизводимости процесса от запуска к запуску и снизить влияние предыдущих образцов на последующую работу.

Следующее преимущество — полная автоматизация процесса. После стандартной предварительной подготовки образца пользователю практически не требуется выполнять дополнительные ручные манипуляции. Образец устанавливается в систему, запускается выбранная программа, после чего на выходе получают готовый материал.

За счёт этого значительно уменьшается количество ручных операций и сокращается время выделения. Если сравнивать, например, с длительными многоэтапными процедурами ультрацентрифугирования, процесс становится значительно проще для пользователя.

Ещё одно преимущество — простота эксплуатации. Прибор интуитивно понятен и не требует сложной подготовки оператора для выполнения стандартных протоколов.

Очень важна и возможность работы с различными типами образцов. В зависимости от материала выбирается соответствующая программа выделения.

Но, пожалуй, наиболее интересны показатели выхода и очистки. По данным производителя, системы обеспечивают высокий выход экзосом по сравнению со многими другими методами.

Степень восстановления экзосом заявлена на уровне более 90%. Это важный показатель, поскольку при использовании некоторых методов часть целевого материала неизбежно теряется на различных этапах обработки.

Кроме того, производитель заявляет удаление примесных белков более чем на 99%.

В презентационных материалах компании представлено большое количество данных, демонстрирующих выход экзосом, степень восстановления и другие показатели.

При этом я специально не стала включать в презентацию большое количество маркетинговых графиков. Любая подобная картинка без подробного описания методики вызывает дополнительные вопросы: какие именно образцы использовались, как проводилось сравнение, какие методы применялись для контроля и так далее. Поэтому гораздо правильнее ориентироваться на опубликованные научные работы. Далее я ещё вернусь к публикациям, потому что их по технологии EXODUS действительно много.

Системы EXODUS можно использовать для широкого спектра биологических образцов.

Это плазма, моча, слюна, цереброспинальная жидкость, слёзная жидкость, культуральные среды и другие типы материалов.

Особенно интересны образцы малого объёма, поскольку именно с ними часто возникают сложности при использовании традиционных технологий.

В материалах производителя представлено большое количество изображений электронной микроскопии. Они позволяют визуально оценить качество и характеристики выделяемых частиц. Электронная микроскопия регулярно используется в публикациях, посвящённых EXODUS, для подтверждения морфологии и размера выделенных внеклеточных везикул.

Ещё одна интересная возможность — применение системы не только для экзосом, но и для выделения вирусов, бактериофагов и других мелких частиц.

Я понимаю, что среди участников сегодняшнего вебинара, возможно, не так много специалистов, непосредственно работающих с вирусами. Тем не менее направление интересное.

Если у вас или у ваших коллег есть подходящий образец и задача по выделению вирусных частиц, можно обсудить возможность прийти к нам на демонстрацию со своим материалом — разумеется, при условии, что работа с данным образцом безопасна и допустима в условиях демонстрационной площадки.

Нам самим было бы интересно протестировать подобные задачи, и, думаю, исследователям тоже было бы полезно посмотреть, какой результат можно получить на их собственном образце.

В материалах производителя представлены примеры выделения лентивирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов и бактериофагов.

Можно увидеть достаточно высокие показатели восстановления вирусных частиц и сохранения их функциональных характеристик после выделения. Поэтому технология потенциально интересна не только исследователям экзосом, но и специалистам, работающим с вирусными векторами и другими наночастицами.

Ещё одна возможность EXODUS, которую я хотела бы отдельно отметить, — выделение отдельных субпопуляций внеклеточных везикул.

Система позволяет работать с мембранами с различным размером пор. Поскольку мембрана входит в состав одноразового картриджа, можно выбирать расходные материалы под требуемый диапазон размеров частиц.

Изначально применялся вариант последовательного разделения с использованием любой из моделей EXODUS. Сначала проводится фильтрация, например с использованием фильтра 450 нм, после чего последовательно выполняются следующие стадии с мембранами, рассчитанными на другие размеры частиц. Этот подход описан в одной из ключевых публикаций, посвящённых технологии.

Если сравнивать с обычным автоматическим запуском, такой вариант, конечно, требует дополнительных действий. Но в целом для EXODUS его всё равно нельзя назвать чрезмерно трудоёмким. Метод позволяет получать отдельные субпопуляции внеклеточных везикул.

Поскольку эта функция оказалась востребованной, производитель разработал специальную модель — EXODUS H-800. Она предназначена для автоматизированного выделения субпопуляций внеклеточных везикул.

В рамках ближайших демонстраций эта модель у нас представлена не будет, но важно знать, что такое решение уже существует. В материалах производителя показано разделение, например, на диапазоны 20–100 нм, 100–200 нм и 200–450 нм. Для исследователей, которым необходимо изучать разные фракции внеклеточных везикул отдельно, такая функция может быть особенно интересна.

Теперь ещё раз вернёмся к производственному формату.

EXODUS T-2800 рассчитана на получение большого количества внеклеточных везикул. Часто при таких задачах речь идёт о материале, полученном из мезенхимальных стромальных клеток — МСК, хотя, конечно, возможны и другие источники.

Сегодня активно появляются задачи, где необходимо получать внеклеточные везикулы уже не в лабораторных микролитровых или миллилитровых объёмах, а в производственных количествах.

Для таких процессов существует конфигурация системы с поддержкой требований GMP. Есть варианты без GMP и варианты, рассчитанные на GMP-процессы, то есть, по сути, различные исполнения оборудования.

Расходные материалы для крупных объёмов достаточно дорогостоящие. При этом есть возможность заказывать комплекты под определённый рабочий объём. На момент подготовки вебинара обсуждались, в частности, варианты примерно для 3, 5 и 10 л исходного материала. Соответственно, стоимость расходного комплекта зависит от выбранного объёма.

Кроме того, если у пользователя есть нестандартная задача, связанная с определённым диапазоном размеров везикул, можно обсуждать изготовление расходных материалов с заданными характеристиками мембраны и размером пор.

Система получила достаточно широкое распространение, и это можно увидеть по количеству научных публикаций.

В ведущих журналах опубликовано большое количество работ с использованием EXODUS. Последняя подборка, которую мне присылали представители компании на момент подготовки вебинара, включала более 50 публикаций.

Большая часть этих работ была опубликована начиная с 2021 года и далее, вплоть до 2025 года.

Материала действительно очень много. В публикациях представлены самые разные применения, сравнения с другими методами, работа с различными биологическими жидкостями, протеомный и метаболомный анализ и другие задачи.

Тем, кому тема интересна, я рекомендую ознакомиться с этими статьями. Практически во всех публикациях EXODUS указывается в названии метода или в разделе методики, поэтому найти их можно и самостоятельно.

При этом у меня есть отдельный файл, в котором собраны более 50 публикаций. Если он понадобится участникам, я могу разместить его на общем диске и прислать ссылку, чтобы не приходилось искать каждую статью отдельно.

Я сама, когда начала подробно изучать публикации, столкнулась с тем, что не все материалы одинаково легко доступны. Поэтому попросила производителя собрать публикации в одном месте, и представители компании предоставили такую подборку.

Статьи действительно интересные, многие опубликованы в высокорейтинговых научных журналах. Это показывает, что система активно используется в исследованиях.

Есть один нюанс, на который я хотела обратить внимание.

На момент проведения вебинара EXODUS была наиболее распространена в Китае и США. На европейском рынке система представлена значительно слабее. Вероятно, это связано как с особенностями регионального рынка, так и с отношением к новым китайским технологическим разработкам и особенностями их выхода на европейские рынки.

Если же говорить об американском рынке, там систему уже несколько лет используют достаточно известные университеты и исследовательские институты. Это можно увидеть как по материалам производителя, так и по опубликованным исследованиям.

Среди пользователей представлены не только научно-исследовательские институты и университеты. Есть также клинические учреждения и большое количество биотехнологических компаний.

Таким образом, технология может применяться в разных типах организаций — от фундаментальных исследовательских лабораторий до клиник и биотехнологических производств.

На этом закончим с EXODUS и перейдём ко второй системе.

Вторая система представлена компанией CytoNiche.

Компания предлагает не только отдельную систему для выделения экзосом, а комплексное готовое решение, включающее расходные материалы и оборудование для культивирования клеток.

Одна из ключевых технологий CytoNiche — культивирование клеток с использованием деградируемых высокопористых микроносителей. Платформа разработана в том числе для масштабирования процессов клеточной терапии и для задач, связанных с клиническим применением.

Я кратко представлю всё портфолио, потому что выделение экзосом — это только один из этапов технологического процесса. Прежде чем выделять экзосомы, необходимо получить достаточное количество исходного материала.

В данном случае сначала выполняется крупномасштабная наработка МСК — мезенхимальных стромальных клеток. Речь идёт действительно о больших количествах клеточного материала. Система для выделения экзосом в этом случае становится частью общего производственного процесса.

Чтобы понимать масштаб, можно посмотреть на биореакторы, представленные в линейке.

Есть одноразовые биореакторы объёмом 5, 15 и 50 л. По словам производителя, формат 50 л достаточно востребован.

Если культура выращивается в таком объёме, то и выделение экзосом из соответствующего количества среды превращается в серьёзную технологическую задачу. Обработать такой объём с помощью небольших лабораторных систем сложно: может понадобиться не одна установка и большое количество последовательных операций.

Поэтому необходимость специализированного производственного процесса здесь действительно существует.

Теперь вернёмся непосредственно к системе для выделения экзосом. Она называется 3D FloTrix vivaEXO.

Система также может использоваться в формате, соответствующем требованиям GMP. Процесс полностью автоматизирован, сама система является закрытой.

Она позволяет мониторировать и записывать параметры процесса, что особенно важно при GMP-производстве, когда необходимы контроль, документирование и прослеживаемость операций.

Обратите внимание и на сравнительно короткое время обработки. По материалам производителя, обработка каждых 10 л исходного раствора занимает приблизительно от 1 до 3 часов.

Система работает по принципу многоступенчатого разделения и фильтрации с использованием технологии тангенциальной фильтрации.

Если сравнивать её с EXODUS, подход здесь несколько другой. Для 3D FloTrix vivaEXO производитель не заявляет тех же параметров чистоты и выхода наночастиц, которые демонстрируются в материалах EXODUS.

Однако у системы есть другие преимущества: высокая скорость работы с большими объёмами и существенно более доступная стоимость. Если говорить о GMP-конфигурациях, на момент вебинара разница в стоимости могла быть очень значительной — ориентировочно в несколько раз.

Для части пользователей этот фактор может оказаться критичным, поскольку бюджеты на производственные системы сильно различаются.

Поскольку система работает на принципе тангенциальной фильтрации, в ней предусмотрен соответствующий модуль для фильтрации.

На схеме можно увидеть обычный по принципу действия фильтрационный элемент. Но поскольку вся система должна оставаться закрытой, предварительную очистку тоже необходимо выполнять в одном замкнутом контуре.

Зачем это нужно? Главная задача — обеспечить соответствие требованиям GMP и сохранить непрерывность процесса без открытия системы на промежуточных этапах.

Поэтому в линейке представлены модули как для предварительной очистки, так и для последующей фильтрации и концентрирования. В частности, используется модуль CLR Processing Kit для фильтрации крупных частиц и примесей. Для концентрирования и очистки экзосом применяются модули PUR.

Всё это объединяется в единый контур. Процесс начинается и завершается в автоматическом режиме без необходимости переносить продукт между несколькими открытыми системами.

В результате можно работать с исходным объёмом в несколько литров и получать значительно меньший конечный объём. Например, 10 л исходного раствора можно сконцентрировать приблизительно до 500 мл. Рабочие объёмы расходных комплектов составляют ориентировочно 3–10 л.

На этом закончим с системой CytoNiche и перейдём к ещё одному направлению, которое сегодня становится всё более востребованным.

Отдельное интересное направление — выделение растительных внеклеточных везикул.

На слайде в качестве примера представлена традиционная китайская медицина. Как известно, в Китае широко используются различные лекарственные растения и растительные препараты: экстракты, отвары, пилюли, порошки и другие формы.

Конечно, их производство требует определённых технологий, однако у традиционных лекарственных форм есть свои ограничения. Среди них можно назвать низкую растворимость отдельных активных веществ, недостаточную биодоступность и нестабильность терапевтического эффекта.

По мнению исследователей, работающих в этом направлении, такие ограничения могут замедлять развитие некоторых подходов традиционной китайской медицины.

Появление систем, способных выделять внеклеточные везикулы из больших объёмов растительного материала, привело к новой идее: возможно, использование непосредственно растительных внеклеточных везикул позволит получать более интересные по свойствам лекарственные формы.

Сейчас в Китае очень большое количество исследовательских групп и биофармацевтических компаний занимается разработкой протоколов получения внеклеточных везикул из растительного материала. Фактически исследуются многие растения, которые традиционно использовались в китайской медицине.

Разрабатываются методы выделения, тестируются характеристики полученных везикул, изучаются варианты их дальнейшего применения. Можно сказать, что в Китае сейчас наблюдается настоящий исследовательский бум в этой области.

В научной литературе и других источниках появляется много информации о потенциальной эффективности растительных внеклеточных везикул при различных состояниях и заболеваниях. При этом важно понимать, что направление продолжает активно исследоваться, и для различных применений уровень доказательной базы может существенно отличаться.

Тем не менее в Китае сейчас это одна из очень заметных тем: исследователи активно пытаются выделять внеклеточные везикулы из самого разного растительного материала.

Отдельно можно было бы говорить о косметологии, хотя подробно на этой теме я сегодня останавливаться не буду.

Растительные везикулы и экзосомоподобные структуры уже достаточно давно вызывают интерес в косметологическом направлении и активно обсуждаются специалистами отрасли. Поэтому здесь также существует потенциально большая область применения технологий выделения и очистки внеклеточных везикул.

На этом основная часть вебинара завершена.

Сегодня мы рассмотрели несколько подходов к выделению экзосом — от традиционного ультрацентрифугирования, эксклюзионной хроматографии и тангенциальной фильтрации до специализированных автоматизированных систем EXODUS и 3D FloTrix vivaEXO.

Отдельно поговорили о работе с небольшими биологическими образцами, масштабном производственном выделении, возможности разделения субпопуляций внеклеточных везикул, работе с вирусными частицами и бактериофагами, а также о быстро развивающемся направлении растительных внеклеточных везикул.